Biología

Brometo de etídio, tampão de carregamento e escada de DNA: visualizando o DNA e determinando seu tamanho

Análise de eletroforese em gel

A eletroforese em gel de agarose desempenha um papel crítico na análise de DNA em experimentos de laboratório. É um método de separação de moléculas biológicas usando uma corrente elétrica. Aprendemos anteriormente que as moléculas de DNA podem se infiltrar nos poros de um gel de agarose. A carga negativa das moléculas de DNA as impulsiona através do campo elétrico em direção ao eletrodo positivo. Moléculas de DNA mais curtas podem viajar mais longe em um gel de agarose em um determinado período de tempo do que suas contrapartes mais longas. A eletroforese em gel de agarose fornece um meio de analisar o DNA, separando as moléculas com base no tamanho. No entanto, por si só, a eletroforese em gel de agarose não fornece um meio de visualizar o DNA. Esse papel é desempenhado por dois corantes: brometo de etídio e tampão de carregamento.

Brometo de etídio

O brometo de etídio se liga ao DNA e fica fluorescente sob luz ultravioleta
Luz UV de brometo de etídio

O brometo de etídio é uma molécula comumente usada para visualizar o DNA em experimentos de eletroforese em gel de agarose. Ele se liga ao DNA e sofre fluorescência nas condições adequadas. O brometo de etídio é conhecido como um agente intercalante. A estrutura plana do brometo de etídio permite que ele se intercale, ou se insira, entre as bases nitrogenadas de uma molécula de DNA. Essa interação é especialmente útil por causa da segunda característica do brometo de etídio. Quando exposto à luz ultravioleta, o brometo de etídio fica fluorescente. Assim, esse produto químico fornece um meio de marcar as moléculas de DNA e de visualizá-las.

No entanto, observe que qualquer molécula que se liga ou altera de alguma forma a estrutura molecular do DNA pode ser perigosa para um organismo vivo. Embora haja algum debate sobre a natureza exata do risco à saúde representado pela exposição ao brometo de etídio, a maioria das organizações e agências o considera um risco. Devido à característica intercalada do brometo de etídio, muitos acreditam que ele representa um risco mutagênico. No entanto, com fortes protocolos de segurança em vigor, o brometo de etídio continua a ser um dos métodos mais comuns de visualização de ácidos nucleicos em experimentos de eletroforese em gel de agarose.

Carregando Buffer

Bem, esse é o fim da história, certo? A agarose separará as moléculas de DNA com base no tamanho e o brometo de etídio marcará as moléculas para que possamos visualizá-las sob luz ultravioleta. Bem, não exatamente. O DNA, como muitas moléculas biológicas, é incolor. Para completar o circuito elétrico, o gel deve ser banhado em uma solução salina chamada tampão de eletroforese. A água também é incolor. Vê o problema?

O tampão de carga é uma solução adicionada a uma amostra de DNA para torná-la visível a olho nu
buffer de carregamento

Se o DNA é incolor e o tampão de eletroforese que banha o gel de agarose também é incolor, como vamos saber se inserimos a amostra de DNA na cavidade do gel ou não? Poderíamos adicionar brometo de etídio e realizar todo o protocolo sob luz ultravioleta, mas isso parece desnecessariamente perigoso para nossa saúde. A resposta é que precisamos usar uma solução diferente, chamada buffer de carregamento . O tampão de carregamento é adicionado a uma amostra de DNA para dar-lhe cor a olho nu.

Observe que monitorar a progressão das moléculas do corante no gel também nos permitirá determinar quando o protocolo está completo. Fantástico. Agora posso dizer se inseri com precisão nossa amostra de DNA no poço. Mas ainda há mais um problema. O DNA é uma molécula aquosa.

Isso significa que é hidrofílico e se dissolve na água. Se nossas amostras de DNA se dissolverem na água do tampão de eletroforese, as moléculas de DNA se espalharão uniformemente por toda a solução e não permanecerão localizadas no poço fornecido.

Portanto, o buffer de carregamento fornece mais uma função na eletroforese em gel. O tampão de carregamento também aumenta a densidade da amostra. Lembre-se de que objetos mais densos afundam, portanto, adicionar tampão de carga às amostras de DNA permitirá que as moléculas de DNA afundem nos poços do gel em preparação para a eletroforese em gel.

DNA Ladder

Embora a visualização qualitativa das moléculas de DNA seja certamente útil, os experimentos geralmente requerem uma análise muito mais precisa do tamanho do fragmento de DNA. Em vez de apenas serem capazes de concluir que o fragmento um é maior do que o fragmento dois, os cientistas muitas vezes precisam ser capazes de concluir que o fragmento um tem três quilobases e o fragmento dois tem um quilobase. Para poder determinar o tamanho de um fragmento de DNA, os cientistas usam algo chamado escada de DNA. Uma escada de DNA é uma solução composta de fragmentos de DNA de comprimento conhecido.

Uma escada de DNA ajuda os cientistas a determinar o tamanho de um fragmento de DNA
Solução de escada de DNA

Como o tamanho de cada banda em uma solução de escada de DNA é conhecido, eles podem ser usados ​​para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA em amostras experimentais. Considere o seguinte experimento. Um pedaço de DNA linear de quatro quilobases foi digerido com uma enzima de restrição. Uma escada de DNA, DNA não cortado e amostras de DNA digeridas foram executadas em um gel de agarose. Veja como as bandas da escada do DNA fornecem um ponto de comparação para as amostras experimentais? Como sabemos os tamanhos dos fragmentos de DNA em cada banda, podemos confirmar que o fragmento não cortado tem quatro quilobases porque se alinha com o fragmento de quatro quilobases na amostra da escada de DNA.

Também podemos determinar que a enzima de restrição cortou este fragmento em fragmentos de três e um quilobase, comparando as bandas na pista da amostra digerida com aquelas na pista da escada do DNA. Para bandas que não se alinham perfeitamente com uma das bandas na escada do DNA, o tamanho pode ser estimado a olho nu ou determinado usando um cálculo matemático. Desta forma, os cientistas podem usar a eletroforese em gel para verificar ou descobrir o tamanho dos fragmentos de DNA.

Resumo da lição

Em resumo, a eletroforese em gel de agarose é um método de separação de moléculas biológicas usando uma corrente elétrica. O brometo de etídio é uma molécula comumente usada para visualizar o DNA em experimentos de eletroforese em gel de agarose. Ele intercala entre as bases nitrogenadas do DNA e fica fluorescente sob a luz ultravioleta.

O tampão de carregamento é uma solução adicionada a uma amostra de eletroforese para dar-lhe cor e densidade. Uma escada de DNA é uma solução composta de moléculas de DNA de comprimento conhecido que é usada para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA em amostras experimentais.

Resultados de Aprendizagem

Depois de assistir a esta lição, você será capaz de:

  • Definir eletroforese em gel de agarose, escada de DNA e tampão de carregamento
  • Lembre-se dos atributos do brometo de etídio
  • Analisar tamanhos de amostras de DNA em experimentos de eletroforese
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